-
Microscopul confocal se referă la un fel de microscop optic special care poate înregistra felii optice.
Prin iluminarea și observarea unui singur punct de limită de difracție, felierea optică este realizată într -un sistem confocal laser. Acest lucru necesită ca cele două segmente de fascicul să aibă același accent, astfel încât acestea să fie „confocale”. Spre deosebire de imaginile cu câmp larg, imaginile confocale nu au o neclaritate defocalizată. Acesta este un avantaj în sine, deoarece imaginea profundă a eșantionului este clară și bogată în detalii. Cu toate acestea, cel mai important avantaj este potențialul său de vizualizare tridimensională cu caracteristici microscopice. După ce secvența de imagine este obținută de-a lungul stivei Z, obiectul 3D este reconstruit și afișat de computer.
- Iluminare confocală
Iluminarea sursei de lumină punctuale este realizată prin focalizarea sursei de lumină pe o deschidere mică (gaură) și apoi concentrarea acesteia pe eșantion. Când deschiderea este suficient de mică, punctul de iluminare este limitat doar prin difracție, nu de parametrii geometrici ai sursei de lumină și deschiderea. Sursa obișnuită de lumină este o sursă mare de lumină de suprafață, astfel încât este imposibil să o concentrezi pe locul limită de difracție. Prin urmare, deși transmisia este foarte scăzută, acest tip de lumină de iluminare concentrată este încă foarte necesară (pentru surse tradiționale de lumină).
Figura 1: Iluminare pentru imagistica confocală. Lumina de la sursa de lumină (LS) este concentrată pe pinul de iluminare (PI) și apoi intră în eșantionul S ..
Laserul ca sursă de lumină are o colimare foarte mare (lumina într -un laser bun este „extrem de paralelă”). Prin urmare, laserul poate fi concentrat pe un loc limitat de difracție printr-o singură lentilă fără a utiliza o gaură. Prin urmare, majoritatea microscopelor confocale nu au o gaură de iluminare. Calitatea locului ușor depinde de calitatea fasciculului laser. Dacă calitatea nu este bună, puteți introduce, de asemenea, pinul de iluminat. Laserul este de obicei cuplat la microscopul confocal prin fibră optică. Aceste fibre în sine acționează, de asemenea, ca găuri.
Focalizarea și densitatea energetică ridicată a laserului îl fac o sursă de lumină ideală pentru microscopul confocal. Coerența laserului nu este o caracteristică necesară a performanței confocale. Dimpotrivă, este o provocare pentru proiectanții optici, deoarece va provoca modele de interferențe false, astfel încât sunt necesare strategii de proiectare atentă.
În plus, faptul că laserul tradițional emite doar o singură culoare (laser- „linie”) are propriile limitări. În imagini și măsurare multi-fluorescență, este necesar un aranjament complex cu mai multe laser. Laser alb rezolvă cu pricepere problema imaginii multicolor.
Figura 2: Comparația imaginii confocale (zona dreaptă) și non-confocală. În trofoblastul de șoarece pătat de Feulgen. O mulțime de informații despre imagini non-confocale nu provin din plan focal. Optica confocală elimină toți factorii fuzzy și face ca structura să fie clară.
Detectarea confocală
Majoritatea detectoarelor au o suprafață sensibilă destul de mare (tuburile fotomultiplicatoare sunt de obicei câțiva centimetri pătrați). Optica confocală are nevoie de detectare a punctului. Prin urmare, este necesar să se efectueze detectarea la fața locului prin introducerea unei deschideri mici (gaură de pin) în fasciculul de lumină. Concentrarea luminii eșantionului pe gaura de pin, colectarea și înregistrarea luminii transmise.
Deoarece modelul de difracție depinde de deschiderea numerică și de lungimea de undă, este necesară detectarea găurilor de pin. Prin urmare, atunci când acești parametri se schimbă, dimensiunea gaura de pin trebuie ajustată.
Când obiectivul obiectiv se schimbă (de obicei odată cu schimbarea diafragmei numerice), microscopul modern de scanare confocală va schimba automat în mod corespunzător diametrul găurilor de pin. Prin urmare, găurile sunt de obicei proiectate ca deschideri duble sau cu mai multe straturi.
De fapt, dimensiunea corespunzătoare a gaurii de pin depinde nu numai de lungimea de undă și de deschiderea numerică, ci și de mărirea internă a elementelor optice la microscop.
Prin urmare, nu este doar nedorit, ci și greșit să comparăm direct diametrele găurilor de pin în microscoape cu modele diferite. Dacă diametrul găurilor de pin nu este setat la valoarea optimă, sistemul nu va putea efectua o feliere optică fără probleme (adică să transmită defocus neclaritate) sau să taie intensitatea inutil, fără a obține o calitate de feliere optică suplimentară (rezultând imagini de zgomot inutile).
Figura 3: Detectarea imaginii confocale. Lumina din eșantionul S este concentrată pe pinul de observare (PO) și apoi pe detectorul de.
Calea optică a scanării confocale
Calea fasciculului confocal în sistemul de scanare confocală este doar combinația de iluminare a sursei punctuale și detectarea punctelor. Această combinație poate fi folosită ca cuțit optic. Doar fotonii din planul focal pot fi transmise senzorului. În timp ce toți fotonii din alte locuri sunt filtrate. Sliția optică este realizată prin intermediul „filtrului spațial”.
Deoarece un singur loc apare imagistică „confocală” într -un anumit timp, este necesar un dispozitiv de scanare pentru a muta locul pe câmpul obiectului într -un mod de grilă. De obicei, oglinda optică este instalată pe motorul de scanare și utilizat pentru a executa procedura de scanare. Există un blocaj în timpul necesar pentru a scana un cadru complet (de obicei) 1.024 de linii. Îmbunătățirile au fost obținute prin introducerea unui scaner de mare viteză (scaner de rezonanță) care scanează 8, 000 sau mai multe linii pe secundă.
Numai sub microscopul tehnologiei luminii reflectate se poate obține o felie optică bună. Acesta este unul dintre motivele dezvoltării viguroase a microscopiei fluorescente în ultimii 20 de ani (alte motive includ inventarea imunostainării, hibridizării ADN, biosenzorului fluorescent, punctelor cuantice și proteinei fluorescente).
Figura 4: De la stânga la dreapta: 1. Conul de iluminare nu numai că excită colorantul fluorescent în planul focal, dar îl emoționează în sus și în jos. Aici reprezentat de un con de dublu verde. 2. Pinhole de emisie interceptează efectiv lumina emisă de deasupra planului focal. 3. În plus, lumina de sub planul focal nu va trece prin gaură. 4. În sistemul confocal, numai lumina din eșantion va ajunge la detector. Detectarea găurilor de pini va respinge efectiv orice lumină din alte zone. În cele din urmă, se obține secțiunea optică reală.
